广东燕塘:乳房炎微生物的实验室检测

2017-10-22 20:23 荷斯坦奶农俱乐部网 访问量:14 [ 字号: ]
罗 旭  广东燕塘乳业
 
 
罗旭
2013年6月至今分别在广东燕塘乳业股份有限公司下属阳江红五月良种奶牛场和湛江澳新牧业有限公司工作及奶源部工作,期间去过现代牧业蚌埠牧场和洪雅牧场学习、宁夏天宁牧校脱产培训,曾担任兽医主任助理。
毕业院校:2013年6月毕业于华南农业大学兽医学院。
牛龄:4年。
业余爱好:看书,打篮球。
 
一、样品采集与处理
1.准备
(1)带有标签的无菌采样瓶,实验前填写需要的表格,表格内容包括牛耳号、乳区、采样日期、采样人等;
(2)确保手干净,且带上双干净的手套
2.清洗乳头
(1)用乳房清洗消毒液来清洗乳头,并且用单独的毛巾擦干乳头
(2)如果允许进行前药浴,时间30s用单独的毛巾擦掉乳头液体
(3)用浸泡过外科手术用的酒精(75%酒精棉球)或甲基化的酒精重复清洗和消毒乳头的末端,直到乳头干净后弃掉酒精棉;
(4)挤掉前几把奶(5或6把)
3.采样
(1)如果采集多个乳区或四个乳区的混合样本,用浸泡过外科手术用的酒精或甲基化的酒精棉签清洗和消毒乳头末端,从最远端的乳头开始采集到最近的。每个乳头用一个干净的棉签拭纸,且每采集一个乳头对手部进行消毒;
(2)收集奶样时,尽可能的使采样瓶水平放置。不要让任何东西接触瓶口或瓶里的液体成分
(3)每个乳区收集1或2把奶,从最近的乳区开始直到最远的乳区。
4.送到实验室
在到达实验室前,冷保存样本(2~8℃,一般设定为4℃);如果24h未将到达实验室,样本可以冷冻起来直到送达到实验室。
二、牛奶样品检测所需的实验室材料——培养基
 
图1  平板培养基和实验试管
1.血平板培养基(Oxoid代码:CM0055)
普通富含血液非选择性培养基。适合诊断具有典型溶血反应的病菌,也是诊断链球菌、葡萄球菌和其他生物体的重要培养基
制备:(1)333毫升蒸馏水放置在500ml耐热的玻璃瓶中;(2)称取13克浓缩的Oxoid血琼脂;(3)将血琼脂加入到水中,充分摇匀有助于血琼脂的溶解;(4)把玻璃瓶放到高压锅中加水没过高压锅内的水线标记盖上盖子。使高压锅升压带温度降下来灭菌的时间15分钟。(5)关闭开关,等待蒸汽停止,然后移去盖子。把牛奶瓶放到水池中,降温到47度。(6)加入一瓶脱纤维绵羊血转圈摇晃混合均匀。(7)将瓶子中的液体倒入灭菌平板,待液体凝固后在平板上标注日期,倒置放入到冰箱中。
2.爱德华培养基(代码:CM0027)
一种选择性培养基富含血液,能够快速分离引起奶牛乳房炎链球菌。
制备:(1)14克爱德华浓缩培养基粉末放到333ml蒸馏水中(称重时带口罩);(2)除了上面的步骤,其余制备步骤和血平板一样。
3.西蒙氏柠檬酸盐培养基代码:CM0155
一种琼脂培养基(固体)基于把柠檬酸作为唯一的碳源来区分肠杆菌科细菌
制备:(1)500ml蒸馏水放到耐热玻璃瓶中;(2)11.5克Oxoid浓缩柠檬酸琼脂倒入蒸馏水中;(3)不加绵羊血;(4)除了以上步骤,其余制备步骤和血平板一样。
4. S.I.M培养基(代码:CM0435)
根据硫化物,吲哚产量和细菌运动性来区分肠杆菌科的细菌培养基。
制备:(1)200ml蒸馏水放到200ml耐热玻璃瓶中;(2)6克Oxoid SIM浓缩琼脂倒入蒸馏水中;(3)不加绵羊血;(4)当冷却后倒入无菌的试管中大约1/3处,覆盖上一层塑料薄膜;(5)除了以上步骤,其余制备步骤和血平板一样。
5. Iso-Sensitest培养基(代码:CM0471)
一种用于检测抗微生物敏感性实验培养基
制备:(1)300ml蒸馏水放到500ml耐热玻璃瓶中;(2)9.3克Oxiod ISO浓缩琼脂倒入蒸馏水中;(3)不加绵羊血;(4)除了以上步骤,其余制备步骤和血平板一样。
6.麦康凯培养基(代码:CM0007或成品代码PO0149A)
一种特异性培养基分离大肠杆菌和水中,奶产品和生物样本中的肠道病原菌
制备:(1)500ml蒸馏水放入500ml耐热玻璃瓶中;(2)26克Oxoid浓缩麦康凯琼脂倒入蒸馏水中;(3)不加绵羊血;(4)除了以上步骤,其余制备步骤和血平板一样。
7.甲基蓝培养基(代码:07012)
用于分离克雷伯氏菌,丙烯酰胺实验室分析,用膜滤法快速计数克雷伯氏菌。
制备:(1)10g克雷伯氏菌琼脂和200ml蒸馏水倒入耐热玻璃瓶中;(2)逐渐加热到沸腾缓慢溶解琼脂,不能用高压蒸汽锅;(3)加入1毫升1%罗斯酸溶液,冷却充分,然后加入5mg羧苄青霉素;(4)混合均匀后倒板。
8. 金黄色葡萄球菌培养基(成品代码:PO01186a)
一种选择性鉴别培养基。用于分离和计数食物中的金黄色葡萄球菌
实验室检测乳样方法
将制备好的培养基或成品培养基放到超净工作台里,使用无菌的接环进行分区在平皿外使用标记笔画分割线进行区分,并且使用奶牛和其它关键信息进行标记
 
图2  接种环高温灭菌                              图3  取待测奶样
1. 加热接环,随后冷却几秒钟
2. 接种10μL的乳样准备画线
3. 在一个血平板和一个爱德华平板用接接种10μ乳样
4. 将加热后的接环放到琼脂培养基边缘冷却一下;
5. 随即在培养基的一边化数条致密的平行线;
6. 将重新加热的环放到琼脂培养基边缘冷却一下;
7. 随即在培养基的另一边化数条致密的平行线(可重复步骤6和步骤7,以便形成单菌落)。
 
图4  接种奶样至平板                        图5  对奶样进行画线
注:如果分离金黄色葡萄球菌,接种环冷却几秒钟接种10μl乳样在金黄色葡萄球菌平皿上不需要画线
 
图6 恒温培养箱
8. 将接种好的培养基放在37℃恒温培养箱里,培养48h;
9. 放置18~24小时检查平皿,爱德华培养基上可以检测到链球菌血平板上可以检测到其他细菌
10. 肉眼看不的乳房炎微生物,采用革兰氏染色法来鉴别
11. 革兰氏阳性菌采用过氧化氢酶和凝固酶实验,进一步确定细菌类型;革兰氏阴性菌采用西蒙枸盐酸盐培养基和SIM培养基实验,进一步确定细菌种类
12. 再培养18~24小时,以便观察平皿生长缓慢的细菌,如牛棒状杆菌,化脓隐秘杆菌和酵母菌
13. 检查培养将新生长出来的细菌进行革兰氏染色和生化鉴定
 
细菌鉴定
1.将不确定的细菌进行革兰氏染色
(1)在载玻片上滴一滴蒸馏水;(2)加热接菌环,进行接种;(3)在蒸馏水中均匀混合;(4)在加热炉上进行烘干;(5)冷却一小会;(6)把冷却后的玻片放在染色槽上;(7)用结晶紫染色玻片1分钟;(8)用水笼头进行冲洗掉;(9)用革兰氏碘液染色1分钟;(10)用水笼头进行冲洗掉;(11)拿起载玻片,用丙酮或者乙醇进行喷洗;(12)立即冲洗掉;(13)把载玻片再次放到染色槽上,用石碳酸品红复染1分钟;(14)用水笼头冲洗掉;(15)弄干载玻片
2.在革兰氏染色后的玻片上滴一滴油,显微镜下观察
(1)100倍物镜,调焦,变焦与革兰氏玻片准,将观察到的东西记录下来;(2)完成观察后,用擦镜纸清洗镜片和镜台
革兰氏染色
 
图7  一滴蒸馏水放在载玻片上                         图8  加热接种环
 
图9  取单一菌落                                图10  与蒸馏水均匀混合
 
图11、12  在加热装置上进行烘干,冷却后放到革兰氏染色槽上
 
图13  结晶紫1分钟                                    图14  水冲洗
 
图15 革兰氏碘液染色1分钟,冲洗             图16  丙酮快速冲洗,水冲洗
 
图17  石炭酸染色1分钟,水冲洗
 
        图18、19  烘干载玻片
 
显微镜下鉴别
 
             图20  葡萄球菌或链球菌           图21 芽孢杆菌,短杆菌或化脓隐秘杆菌
 
图22  革兰氏阴性菌,棒状                       图23  紫色卵圆形酵母菌
 
培养基上细菌
 
图24  血平板牛棒状杆菌                    图25  血平板化脓隐秘杆菌
 
图26  爱德华培养基的无乳链球菌          图27  血平板酵母菌
 
图28  血平板上的金黄色葡萄球菌         图29  金黄色葡萄球菌
 
图30  血平板的变形杆菌                    图31  血平板假单胞杆菌
 
图32  麦康凯培养基的大肠杆菌                    图33  血平板大肠杆菌
 
图34  血平板上的克雷伯氏菌                     图35  血平板上葡萄球菌
 
图36  血平板上芽孢杆菌                  图37紫外线下培养基上的乳房链球菌
 
图38  爱德华培养基上的停乳链球菌
 
继续进行细菌鉴定
1. 革兰氏阳性菌球状(镜检紫色球状):葡萄球菌链球菌鉴别
 
 
图39  葡萄球菌与链球菌鉴别方法
 
2.革兰氏阳性菌镜检棒状
芽孢杆菌通常肉眼就能观察到不需要革兰氏染色,牛棒状杆菌和短杆菌用过氧化氢酶实验进行鉴定,阳性为前者;革兰氏染色小簇革兰氏阳性棒状菌,与棒状杆菌进行区分采用血平板培养,微小、光滑比较集中的菌落形态,48小时后化脓隐秘菌落周围出现0.5~1mm溶血环。
3.革兰氏阴性(粉红色棒状)
大肠杆菌大肠杆菌群克雷伯氏菌肠杆菌沙雷氏菌、假单胞菌巴氏杆菌和变形杆菌鉴别需用到西蒙氏柠檬酸盐培养基、克雷伯氏菌培养基、S.I.M培养基;克雷伯氏菌培养基深蓝色至蓝灰色性菌,没有必要再看其他养基。如果菌落是粉色或淡黄色参照图40、图41。
 
图40  柠檬酸盐培养基呈绿色:阴性
 
图41  柠檬酸盐培养基呈蓝色:阳性
4.柠檬酸盐培养基
绿色=阴性,蓝色:阳性;S.I.M三个试验:新菌落出现,运动实验阳性培养基混浊,阴性接种线无反应;硫化氢试验:阳性,培养基出现黑色;吲哚反应:加0.2ml吲哚试剂在反应管中,反应10分钟,阳性反应管中出现红色环状。
药敏性实验
 
图42  药敏性实验平板
药敏性实验结果对牧场乳房炎治疗有一定的指导作用;而乳房炎的细菌培养、鉴定对乳房炎的预防有一定的指导意义。
广东燕塘乳业股份有限公司
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