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生乳快速检测方法的研究
2019-05-11 荷斯坦奶农俱乐部网  访问量:513   屈雪寅 王洋 王巍 于静 天津梦得集团有限公司  [ 字号: ]

屈雪寅 王洋 王巍 于静 天津梦得集团有限公司

为保障牛奶质量安全,我国制定了生乳的有关标准,对影响生乳质量安全的相关指标进行了限量和要求。对于部分指标,采用国家标准中要求的方法进行检测,耗时较长。快速检测方法,检测时间短,易操作,利于生乳收购和牧场监测。本文就目前国内乳品企业和监管部门对生乳的快速检测方法进行综述。
 
牛奶质量安全日益受到消费者关注,对于政府监管部门和乳品生产企业来说,乳品质量安全是严峻的挑战和义不容辞的责任。近年来,除《生乳》国标外,农业农村部每年制定监督抽检计划,对涉及生乳质量安全的指标监测,以保障乳品质量安全。部分地区,如上海和江苏地区,也率先推出“按质论价”,推动生乳质量安全提升。很多乳品企业也制定了严于国标和行标的企标,用于收购生乳,从加工源头控制乳品质量安全。
关于生乳的限量标准,GB19301-2010《食品安全国家标准 生乳》,对冰点的要求为-0.500℃~-0.560℃(荷斯坦奶牛牛奶,挤出3小时后),对相对密度的要求为≥1.027(20℃/4℃),蛋白质的要求为≥2.80(g/100g),脂肪的要求为≥3.10(g/100g),杂质度的要求为≤4.0 mg/kg,非脂乳固体为≥8.1(g/100g),酸度的要求为牛乳12~18°T,羊乳6~13°T,菌落总数为≤2×106 CFU/mL。污染物的限量为黄曲霉毒素M1 0.5 μg/kg(GB2761-2017),铅0.05 mg/kg,汞0.01 mg/kg,砷0.1 mg/kg,镉0.3 mg/kg(GB2762-2017);生乳硫丹0.01 mg/kg,艾试剂0.006 mg/kg,DDT0.02 mg/kg,狄氏剂0.006 mg/kg,林丹0.01 mg/kg,六六六0.02 mg/kg,氯丹0.002 mg/kg,七氯0.006 mg/kg(GB2763-2017)。关于兽药残留,农业部2002年颁布的235号公告共规定了49种兽药残留的最大残留限量,41种在牛奶中不得检出。此外,为进一步打击在食品生产、流通、餐饮服务中违法添加非食用物质和滥用食品添加剂的行为,保障消费者健康,全国打击违法添加非食用物质和滥用食品添加剂专项整治领导小组自2008年以来陆续发布了五批《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂名单》。将乳及乳制品中三聚氰胺、革皮水解物、工业火碱、硫氰酸钠、β-内酰胺酶加入到食品中可能违法添加的非食用物质名单中。
同时,根据生乳的定义:从符合国家有关要求的健康奶畜乳房中挤出的无任何成分改变的常乳。产犊后七天的初乳、应用抗生素期间和休药期间的乳汁、变质乳不应作为生乳(GB19301-2010)。乳品企业在收购生乳时,还会针对兽药残留和变质乳进行测定。由于生乳不易贮存等特点,要求检测时间不能过长,以免发生腐败。而国家标准中规定的检测方法,部分需要长时间的前处理和仪器操作过程,对于乳品企业的收购时间上造成难度。因此,在规定方法检测的基础上,先进行快速的筛查检测,基本确定生乳的质量安全后,再进行收购操作,显得尤为重要。
《生乳》国标限量参数的快速检测方法
蛋白、脂肪、非脂乳固体
目前对蛋白、脂肪、非脂乳固体的快速测定方法中,使用较广泛的为乳成分分析仪,主要是利用脂肪、蛋白、碳水化合物等含有的O-H、C-H、N-H、S-H键在红外光区(图1)有吸收的原理,利用朗伯-比尔定律(图2),通过已知浓度定标后得到待测物质的浓度。由于脂肪球本身的反射作用及运输过程中导致的形态和均匀度的变化,以及定标操作等,均会影响测定结果,需定期使用与分析样品基质一致的校准样品对仪器进行校准。但乳成分分析仪测定时间较快,平均一个样品2~5分钟,可同时测定蛋白质、脂肪、非脂乳固体、乳糖等,还可同时测定酸度、冰点等组分作为参考值。作为收购和指导生产过程使用操作性较强。
 
图1 光谱区段
 
图2 朗伯-比尔定律
酸度
酸度是反映牛奶新鲜程度的重要指标之一。20世纪已有乳酒精稳定性测试,用70%的酒精与等比例的生乳混合后,如出现沉淀则表明原料乳质量较差不能接受。
目前,《生乳》中酸度的方法采用GB5413.34-2016《食品安全国家标准 食品酸度的滴定》中第一法滴定法。滴定法滴定过程时间较快,但操作较复杂,如需制备参比溶液,且2小时即更换;同时滴定空白溶液;标准氢氧化钠溶液标定等。
GB5405-85《生乳检验方法》中利用68%,70%,72%的酒精对生乳的酸度进行快速实验,出现絮状碎片的生乳酸度分别为20°T、19°T和18°T,因此出现絮片的生乳酸度过高。虽然目前该标准已作废,但是此种方法由于快速和易操作性,仍然被乳品企业在收购时使用。但是,有文献表明,当酸度大于18°T时,酒精实验不能完全显示阳性。该方法也仅能作为参考方法,判断酸度时还应结合pH值等。
黄曲霉毒素M1
国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer,IARC)将黄曲霉毒素B1列为Ⅰ级致癌物;黄曲霉毒素M1列为Ⅱ级致癌物。黄曲霉毒素B1进入奶牛体内,代谢到奶中,转化为黄曲霉毒素M1。我国对生乳中黄曲霉毒素M1的限量为0.5 μg/kg,欧盟成员国等国家采用0.05 μg/kg为生乳中最大残留限量值。
对于黄曲霉毒素M1的快速测定方法,目前比较主流的方法为酶联免疫法,原理是依据抗原抗体法,样品中残留的黄曲霉毒素M1与微孔板中包被的抗体反应,多余的抗体与抗原结合,通过发光标记物质显色测得吸光度。通过已知浓度标准曲线,得到待测样品浓度。在农业行业标准NY/T1664-2008《牛乳中黄曲霉毒素M1的快速检测 双流向酶联免疫法》中用酶联免疫法快速检测牛奶中黄曲霉毒素M1。GB 5009.24-2016 《食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素M族的测定》方法中第三法酶联免疫吸附筛选法作为筛查测定方法。可见,随着酶联免疫方法技术的成熟,已逐渐被认可,作为快速筛选法纳入国家标准和行业标准中。
商品化酶联免疫试剂盒通常配备一套试剂及抗原抗体标记板,检测时间通常为1~2个小时。相对于高效液相色谱法和液相色谱-串联质谱法,省去了复杂的前处理步骤和仪器的运行分析时间。而且酶联免疫试剂盒操作简便,对于技术性的要求不高。
菌落总数
针对微生物的快速检测技术,近年发展较快的技术有全自动微生物分析系统,包括全自动rRNA基因指纹技术、全自动微生物检测技术、Sherlock全自动微生物鉴定系统等;基于PCR技术,包括实时定量PCR技术、PCR-变性梯度凝胶电泳联用技术等;DNA芯片技术和生化快速检测试剂盒等。GB4789.2-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验菌落总数的测定》采用的是琼脂计数培养基培养后计数的方式。该方法处理和培养的过程超过48 h,且操作较为复杂。
菌落总数测试片为比较成熟的食品微生物快速检测方法,并获得AOAC官方认可的方法。试纸片由上层的指示剂和下层的培养基两个再生水化干膜部分组成,菌落生长后呈红色分布。将样品原液或稀释后的样品溶液滴于测试片中,进行培养后计数。该方法较国标方法相比,省略了培养基的配制时间,测试片较培养皿相比厚度上基本为纸片厚度,节省了培养箱的占用体积,避免了人员配制过程中的操作误差。
兽药残留
兽药残留的检测方法主要有仪器方法和微生物分析方法。仪器分析方法以液相色谱、液相色谱-串联质谱和气相色谱-串联质谱为主。微生物方法是使用嗜热链球菌和嗜热脂肪芽孢杆菌抑制法,判断生乳中是否含有抗生素(GB/T4789.27-2008)。与快速检测方法中Delvotest试剂盒法也是基于这一原理,将嗜热脂肪芽孢杆菌置于微孔中,加入牛奶后,若无抗生素残留,微生物产酸使紫色的培养基变为黄色;若含有抗生素残留,则不变色。此方法适用于牧场和乳品企业作为快速筛查使用,仅需培养2.5h即可得到结果。另一类较常见的快速测定试剂盒是基于免疫法的试剂盒,将抗体固定在试管或试纸条上,通过颜色变化或仪器读数判断是否含有抗生素残留。此类技术可对抗生素进行到类的判定。如大环内酯类、磺胺类、β-内酰胺类、喹诺酮类等等。
违法添加指标的快速检测方法
β-内酰胺酶
β-内酰胺酶在牛奶中的残留主要来源于内源性和外源性。内源性主要是由生乳中的微生物产生,包括革兰氏阳性菌(青霉素酶和头孢素酶)和革兰氏阴性菌(种类繁多)。微生物产生β-内酰胺酶可能与牛奶贮存时间过长、不合理使用抗生素药物等因素有关。外源性的β-内酰胺酶主要是违法添加,作为拮抗剂掩盖生乳中的β-内酰胺类药物的残留浓度。长期饮用会对人体健康带来风险。
β-内酰胺酶的检测方法主要有微生物法,包括显色培养法、杯碟法等。因缺少相关国家和行业标准,卫生部卫监督发〔2009〕44号《卫生部关于印发乳及乳制品中舒巴坦敏感β-内酰胺酶类药物检验方法-杯碟法的通知》中的方法一直被作为生乳中β-内酰胺酶的检测方法。该方法的检出限为4 U/mL。
在快速检测方法中,主要是采用免疫层析技术的定性方法。利用β-内酰胺酶可分解奶及奶制品中的β-内酰胺类抗生素原理,通过测定被β-内酰胺酶降解后的β-内酰胺类抗生素的残留量,判定牛奶有无β-内酰胺酶。方法实际上是测定β-内酰胺类抗生素,有β-内酰胺类抗生素残留的则说明样品中无β-内酰胺酶,无β-内酰胺类抗生素残留的则说明样品中含有β-内酰胺酶。所以β-内酰胺酶的试纸条判读方法与其他参数相反。方法的检出限通常为2~4 U/mL,低于杯碟法检出限,方可作为快速筛查方法。
 
图3 β-内酰胺酶胶体金试纸条结果判定
三聚氰胺
自2008年“三聚氰胺”事件以来,我国乳品行业受到严重打击。三聚氰胺也一直作为监管部门和乳品企业的重点监测指标,以免再度发生三聚氰胺作为非法添加的事件。GB/T 22388-2008《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》中,第一法为高效液相色谱法(HPLC),第二法为液相色谱-质谱/质谱法(LC-MS/MS),第三法为气相色谱-质谱联用法(GC-MS和GC-MS/MS)[33]。其中,高效液相色谱法相对其他两种方法,检测时间较短,检测步骤相对简单,定量限较高(HPLC 2 mg/kg,LC-MS/MS 0.01 mg/kg,GC-MS和GC-MS/MS分别为0.05 mg/kg和0.005 mg/kg)。
目前三聚氰胺的快速检测方法较成熟,市场化的商品有免疫层析法的胶体金试纸条或试纸卡和酶联免疫法(ELISA)试剂盒。检出限大多数在0.005 mg/kg~0.05 mg/kg。许多行业标准和地方标准,也将试剂盒方法列为标准方法。如SN/T 4538.1《商品化试剂盒检测方法 三聚氰胺 方法一》和SN/T4538.4《商品化试剂盒检测方法 三聚氰胺 方法四》,DB34/T1374-2011《生鲜乳中三聚氰胺的测定酶联免疫吸附法》。
生乳在储存放置的过程中,保存不当或保存时间过长,产生发酵酸度。为掩蔽生乳的酸败,有违法分子向乳中添加碱类物质以掩盖过高的牛奶滴定酸度。GB5409-85《牛乳检验方法》中,对于生乳中碱类物质的检验方法为玫红酸溶液与生乳各5 mL混合后观察颜色变化,呈玫红色证明有碱类物质的存在。GB/T5009.46-2003《乳与乳制品卫生标准的分析方法》中,使用溴麝香草酚蓝指示剂验证掺入碱类物质,同时通过指示剂与生乳接触环的颜色,可大致判断掺碱类物质(碳酸氢钠)的含量。方法的原理是溴麝香草酚兰变色范围为pH6.0~7.6。生乳中掺假碱类物质,加入溴麝香草酚兰指示剂后呈黄绿色,掺碱浓度越高颜色越深。以上两个标准均于2010年废止,废止后暂无碱类物质检测标准替代。因此,目前监管部门和乳品企业仍然延用这两种方法作为判断生乳中是否掺入碱类物质的依据。
硫氰酸钠
硫氰酸钠是牛奶中天然存在的抗菌系统(乳过氧化物酶)中的重要组成成分,内源性的硫氰酸钠在牛奶中的含量约为5-8.5,mg/L。正因为硫氰酸钠具有抗菌特性,不法分子添加硫氰酸钠作为生乳保鲜剂,以抑制生乳中微生物繁殖导致的腐败。过量摄入硫氰酸根,对胎儿和婴儿的神经发育产生影响。超过15 mg/L的硫氰酸钠被认为是可能外源性添加(FAO,2013)。牛奶中硫氰酸的测定暂无国家和行业标准,测定方法一直采用的是《关于印发全国打击违法添加非食用物质和滥用食品添加剂专项整治抽检工作指导原则和方案的通知(食品整治办[2009]29号)》中规定的离子色谱法。此外,文献中报道的方法有高效液相色谱法,紫外分光光度计法等。
针对硫氰酸钠的快速检测方法,目前试剂盒方法采用的是酶标仪代替紫外分光光度计的方式。将生乳进行脱脂和预处理后,加入显色液,根据显色的浓度来判断生乳中硫氰酸钠的含量。与ELISA方法不同的是,并没有采用抗原抗体的免疫法,仅将酶标空白板作为反应和上机的载体。
展望
生乳极易受到微生物污染,采样用具、乳房、乳头和操作过程都可能导致微生物成对数繁殖(Megha and Annadurai, 2014)。因此,快速的检测技术,能够避免在乳品收购时造成牛奶发生微生物繁殖过快,避免影响产品质量。同时,快速检测技术也适用于牧场实验室,对大型仪器设备和人员的要求较低,便于控制生乳质量安全。对于监管部门来说,快速检测方法,能够实现抽检,避免样品带回实验室检测的性质变化导致的测定结果不稳定。近些年,随着对快速检测方法的需求增多,越来越多的商品化检测试剂盒产品面市,方法各不相同,优缺点并存。而且,生产厂家良莠不齐,导致试剂盒产品质量参差不齐。给检测结果的准确度带来了挑战。因此,用户在使用试剂盒时,还应该具备辨别试剂盒质量的能力。如对试剂盒或试纸条进行评价,或在检测过程中进行阳性和阴性质控样品。虽然,目前快速检测试剂盒能够满足绝大部分的生乳安全参数的检测。但对于诸如重金属、微量和常量元素之类的指标,目前市面上还尚缺少快速检测试剂盒。因此,快速检测技术还有待开发出更多的品种。
(国家奶牛产业技术体系,基金来源:现代农业(奶牛)产业技术体系建设专项,CARS-36;天津市现代奶牛产业技术体系创新团队建设专项(ITTCRS2017006);)
 





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