YnteSchukken 荷兰GD动物保健公司首席科学官

    YnteSchukken

    荷兰瓦赫宁根大学牧场动物健康管理学教授

    荷兰乌得勒支大学兽医学院牧场动物疾病控制项目客座教授

    荷兰GD动物保健公司首席科学官。

    1985年获得荷兰执业兽医师资格，1990年获得乌得勒支大学兽医学博士学位，曾连续16年担任美国康奈尔大学牛群健康与流行病学教授。1999年以前一直在荷兰从事兽医临床工作，1999年开始在北美担任牛奶生产服务总监，2013年回到荷兰担任GD动物保健公司首席科学官。研究方向是动物疾病流行病学和病理学。

介绍

大肠杆菌性乳房炎的一种严重的疾病。今天我给大家简要介绍大肠杆菌乳房炎的生物学机理，包括牛只的免疫系统如何应对。

产后临床型乳房炎

图1

图1是美国一个牛场，横轴是泌乳时间，纵轴是临床性乳房炎的风险。我们可以看到，大部分临床性乳房炎都是发生在产后，而且绝大部分都发生在产后非常短的时间内。

妊娠晚期乳房内感染和临床型乳房炎风险

图2

这是英国的一个研究，他们发现很多时候产后出现乳房炎的奶牛其实在干奶期就感染了。图中红色柱状图表示这些牛在妊娠期晚期已经出现乳房炎感染，他们在产后出现临床性乳房炎的发病率非常高。另外，其实在产前的两到三周，也就是干奶期最后两到三周，这时候患大肠杆菌乳房炎机率最高。

大肠杆菌感染和临床型乳房炎

图3

图3是以分子或者DNA分析的方法，更加直观表示异常性牛只。黄色代表在干奶期所分泌出的细菌，紫色是泌乳期乳沟分泌出来的细菌。从图3中我们看到，在干奶期所分离出来的细菌和它产后出现临床性乳房炎分泌出来的细菌是完全一样的，也就是说在干奶期最后阶段出现感染的牛在产后会立即出现大肠杆菌乳房炎。

从免疫系统角度来说，它有很多先天性的因素，比如解剖、体液或乳铁蛋白的问题；有一些细胞性的因素，包括巨噬细胞和中性粒细胞。还有一些自适应性工作，比如感染的历史和免疫接种。

物理屏障

图4

图4是乳头末端，乳头末端的质量对于预防乳房炎非常重要。在你的牛场中，你也可以关注一下这些乳头的质量，看看乳头质量到底是好还是差。

体液免疫：乳铁蛋白

图5

微生物需要铁进行代谢，乳铁蛋白中的铁是不可被其利用的。乳铁蛋白能够凝聚住铁，铁对于细菌的繁殖是不可或缺的。在干奶期，乳铁蛋白的含量非常高，这是非常重要的。从图中我们可以看到，在产前两周，乳铁蛋白的含量会下降，这时大肠杆菌感染的风险就会增加。另外，细胞中如果出现能量不平衡，那么，产生乳铁蛋白的细胞也就没有那么活跃。所以，在妊娠晚期，牛本身吃的会很少，容易出现能量负平衡的问题，乳铁蛋白的含量会下降。

细胞免疫

图6

正常牛奶中细胞总数应该小于10万/ml。正常牛只细胞中主要细胞是巨噬细胞，如果患了乳房炎，中性粒细胞会进入到奶牛中。所以，奶牛中细胞数量会增长。在乳房炎感染的奶牛中，几乎99%或者100%的细胞都是中性粒细胞。

牛奶中细胞

图7

图7中左边是巨噬细胞，右边是中性粒细胞。中性粒细胞有很多触角，它们是乳腺的保护体，这些触角可以感知、发现一些不良的细菌。如果这些触角感知到了乳腺内存在一些异常细菌，它们就会召唤勇士，勇士就是中性粒细胞。所以，在正常的牛只牛奶中，体细胞数应该在5万左右。

图8  未感染乳区体细胞数——样本均值

图9  未感染乳区体细胞数 95%以上置信区间

体细胞数量会上下波动，有时候高一些，有时候低一些。正常牛只体细胞数量是5万/ml，但也会出现一些波动，在最高的时候，健康牛只的体细胞数量可以达到15万甚至20万。我们对牛场内的牛进行体细胞数检测的时候，可以把20万作为一个阈值，超过它就不是健康的牛只了。

乳房内感染

图10

健康牛只体细胞中大部分细胞是巨噬细胞，这些巨噬细胞其实是牛只健康和乳房健康的守护者，它能够预防乳房被细菌所感染。如果牛只感染，就会出现一些炎症。正常的乳腺，即使体细胞数量较低，也含有很多细菌，只不过是健康的、正常的细菌。如果出现一些异常细菌侵入，这时体细胞数量会发生变化，大部分时候都会下降。

11组泌乳牛中牛奶微生物

图11

图11纵轴代表发现的细菌种类数量。从图中我们可以看到，在健康乳区的体细胞数量并不算高，但是，细菌的种类非常多。而在一些出现乳房炎的乳区，细菌种类没有那么多。但是，某一种细菌数量非常大，比如大肠杆菌。因此，临床性乳房炎或者大肠杆菌乳房炎，因为一种细菌的迅速扩充，会取代其它细菌，造成细菌种类的减少。

巨噬细胞识别病原

图12

在正常牛奶中存在着健康的守护者——巨噬细胞，巨噬细胞可以识别细菌。图中淡黄色是巨噬细胞，巨噬细胞能够识别细菌，它识别细菌之后，会产生一个细胞因子，细胞因子会吸引中性粒细胞，这些吸引中性粒细胞的细菌因子具有细菌作用器。

病原特异性：细胞因子曲线

图13

不同细菌的细菌因子是不一样的。比如大肠杆菌产生的细胞因子数量非常大，而金黄色葡萄球菌的细胞因子就会比较少。细胞因子跟临床的表现也有关系，细菌因子越多，会更多地表现出发烧等临床症状。所以，在你的牛场里，如果看到感染大肠杆菌乳房炎，表现出来的症状会更加明显一些，如果感染链球菌或者其它菌表现症状就没有那么明显。

病原特性：产奶量损失

图14

图14中纵轴代表产奶量，方块曲线代表大肠杆菌。我们可以看到，牛感染大肠杆菌之后，产奶量急剧下降，它的表现会非常突出。下面这张图的纵轴也代表产奶量，感染的是金色葡萄球菌，感染期比较长。但是，感染之后对于奶量的影响并没有那么大。所以，不同细菌感染之后机体的免疫反应、细胞因子的响应及它的临床表现、产奶量的影响都是不一样的。

中性粒细胞的趋化性

图15

乳房内大肠杆菌感染作为所有乳房内感染的模型

•大肠杆菌和脂多糖

•脂多糖和Toll样受体

• Toll样受体和核转录因子

•核转录因子和细胞因子

•细胞因子和疾病

大肠杆菌细胞壁包含内毒素

图16

吞噬和杀灭

图17

图17左边这些是细菌，细菌表面上附着了一些抗体。中间图代表的是中性粒细胞，中性粒细胞识别到了这些细菌和抗体，所以，它想把细菌包裹起来，然后杀灭它。右图上可以看到细菌被中性粒细胞完全包裹起来，然后要杀灭掉细菌。因此，对抗细菌的战争中，中性粒细胞是勇士，每一场战役都需要勇士，都需要中性粒细胞。中性粒细胞杀灭大肠杆菌的能力越强，牛只显示出来的临床症状的时间越短。

中性粒细胞吞噬和杀灭大肠杆菌

图18

图18是中性粒细胞杀灭大肠杆菌，中性粒细胞会把细菌包裹起来，然后，它会释放出一些毒素，大家可以看到颜色越来越深，表示它已经杀灭了细菌。最后，它会把细菌清除。这个时候细菌被完全清除掉了。

大肠杆菌感染持续性在上皮细胞上存在

图19

大肠杆菌：持续乳房内感染

图20

如果杀灭过程不顺利的话，细菌没有被完全杀灭，会出现长期的感染。图20是我们在康乃尔大学实验室所购买的一头牛，我们每天都要对它进行牛奶采样，采了80天，每天都会发现牛奶中能够分离出大肠杆菌。也就是说这头牛的中性粒细胞的杀灭能力没有那么强，没有把细菌杀灭。当然有可能是这头牛本身问题，也可能是某一个或者某一组大肠杆菌的菌种的抵抗能力很强，所以，它能够抵抗中性粒细胞的杀灭。

总结

图21

乳腺中大肠杆菌跟普通的大肠杆菌不一样。有一些基因在乳腺大肠杆菌中出现的非常显著，而在一些非乳房炎大肠杆菌并没有出现。也就是说乳腺中的大肠杆菌的菌群跟普通的常见的大肠杆菌的菌群是不一样的。所以，我们可以看到有各种各样的感染。

如果牛体内有足够的中性粒细胞，而且它的杀灭能力很强，那么，它就能够缩短临床症状表现的时间。所以，如果牛体内有足够的中性粒细胞，它的感染期就会缩短。如果细菌进入细胞，也就是说没有被杀灭，那么，就会造成长期的感染。如果杀菌能力不强，就会造成非常严重的脓毒性的乳房炎。

大肠杆菌乳房炎的治疗

大肠杆菌治疗 ——头孢噻呋

图22

这是我们在康乃尔大学做的几项研究。第一，我们用头孢噻呋进行大肠杆菌乳房炎治疗，灰色的柱状代表用头孢噻呋治疗的组，黑色的代表对照组。治疗之后，对于大肠杆菌和克雷伯氏菌的影响都非常显著。从细菌杀灭和临床治愈的角度，效果都很明显。

大肠杆菌治疗恩诺沙星，5mg/kg

第二种措施是用恩诺沙星（拜有利）进行治疗。比较治疗组和对照组可以发现，在对照组细菌数量非常高，而且病死数量也很高。而用恩诺沙星（拜有利）治疗之后，细菌数量会下降，且所有牛在治疗后都没有死亡。所以，对于病牛进行抗菌素的治疗，能够帮助杀灭体内细菌。

大肠菌群治疗

图23

图23是对牛进行病毒攻击后对不同处理进行比较。有的没有治疗，有的使用抗生素治疗，还有用抗生素+消炎药。图中牛的两个乳区都出现了大肠杆菌乳房炎，左边只用抗生素治疗，右边用抗生素+消炎药治疗。我们可以看到使用抗生素+消炎药治疗的乳区对临床症状的缓解发挥了非常大的作用。

大肠菌群治疗

图24

这是细胞群的分布图，左边只用了抗生素，右边用抗生素+消炎药。我们可以看到左边有很多中性粒细胞，还有很多细菌；而右边是非常干净的图片，里边中性粒细胞的数量非常少。所以，利用综合性的全身性抗生素治疗之后，病牛的成活率会提高很多。对于大肠杆菌多感染情况，如果没有治疗，死牛率和淘汰率是30%。而治疗之后，淘汰率降到12%。

上面是美国牛场的治疗规范，如果病牛出现了非常严重的乳房炎表现，我们会对它进行采样，如果高烧，我们马上对它用抗生素进行治疗。24h后，我们根据培养结果决定用抗生素治疗还是采用其它方式治疗。所以，在牛场中，可以根据类似的治疗规范，每次对病牛的分析决定需不需要对它进行治疗。

当然，治疗是非常重要的。但是，还有其它方式可以改善牛只的状况。第一，改善免疫应答。其中非常重要的一个手段就是要密切监测乳头末端的质量。如果你们牛场中的牛只乳头质量非常好，免疫应答就会很高，感染率很低。乳头末端的主要影响因素，第一，挤奶程序；第二，挤奶设备的质量。

与严重性相关的宿主因素

图25

另外一点就是能量负平衡对于治疗的影响。如果奶牛在分娩前游离脂肪酸比较多，它在产后出现酮病酮血症的机率就越高。如果它的游离脂肪酸比较多，又出现产后酮血症，意味着大量的中性粒细胞汇集到乳腺中，乳房内感染大肠杆菌的严重程度就更高。另外，如果牛在干奶期有很多游离脂肪酸，分泌乳铁蛋白的浓度也会下降。

硒和免疫应答

牛的营养对于大肠杆菌乳房炎的严重程度也会有很大的影响。特别是硒和维生素E对于免疫系统的治疗有很大影响。

图26

图26中我们对一组牛进行硒营养补充，另一组是对照组。我们看到在硒补充组，硒感染率会下降很多，自愈率会提高很多。所以，硒是非常重要的补充营养物。

改善免疫应答

市场上有很多产品可以改善牛只的免疫应答，现在主要用在肉牛上。但是，对于我们理解奶牛的免疫应答系统也是非常有帮助的。

牛粒细胞菌落刺激因子(rbG-CSF)

•刺激骨髓产生免疫细胞嗜中粒细胞；

•提高免疫细胞功能。

图27

牛粒细胞菌落刺激因子(rbG-CSF)

图28

图29

我们可以看到，如果用菌落刺激因子去治疗病牛，病牛乳房炎的发病率就会比对照组低很多。这是令人非常振奋的、非常好的研究领域，主要看如何来改变牛只本身的免疫应答，来让它更好地应对大肠杆菌的感染，包括对于免疫应答系统的治疗有什么影响。

获得性免疫的重要性？

图30

大肠杆菌疫苗

图31

图31是大肠杆菌乳房内感染的严重程度。纵轴代表细菌数量，无论是感染乳区的数量，还是细菌数上，接种牛的表现都更好一些。这也是未来非常重要的一个研究方向。此外，干奶期的操作对于预防大肠杆菌乳房炎也是非常重要的。

J5疫苗和乳房炎预防

图32

革兰氏阴性疫苗功效1-(4.5/7.2) = 36%

在美国会给牛注射大肠杆菌疫苗。图32是美国几年前做的研究，红色代表接种的疫苗组，蓝色代表对照组。我们可以看到，疫苗组的克雷伯菌和大肠杆菌感染增加的不多。当然，接种是有效的，但是，它也不是最完美的解决方案。这个研究中，接种之后，发病感染率下降30%-40%。

疫苗减少严重性

图33

另外，这些牛只接种之后，在临床症状上也缓解了很多。所以，它的产奶量的损失比对照组少很多。我们从图33中可以看到，接种疫苗后产量损失可以减少50%，也就是说疫苗不是提供一个完全保护，而是可以缓解症状。

图34

即使“最好的疫苗”也可能失效

总结

大肠杆菌是造成临床型乳房炎的重要原因，现在很多大型牧场都比较重视大肠杆菌乳房炎。上面我介绍了免疫功能的重要性。中性粒细胞为什么重要？因为中性粒细胞的数量和杀灭能力都是非常重要的。研究结果证明乳房炎治疗很重要，它能够杀灭细菌，挽救病牛。但是，乳房炎的预防更关键。现在，针对奶牛免疫应答开展的研究越来越多。免疫应答曲线是大肠杆菌特定的，持续性感染被观察到是大肠菌群，包括大肠杆菌。因此，治疗大肠杆菌乳房炎很划算。

干奶期最后两到三周的管理对于预防大肠杆菌乳房炎非常重要。免疫应答的干预，除了宿主因素外，我们还要考虑营养因素如能量负平衡、补充硒和维生素E，整个牛场的管理对于保障乳房健康是非常重要的。我们刚才也讲到很多刺激免疫系统发挥作用的例子。另外，我们还可以采用很多干预的措施来提高免疫系统的能力。最后，研究数据告诉大家免疫接种非常重要，还有很多新的保护措施，包括在乳腺上皮细胞层面对牛只进行保护。（本文根据YnteSchukken博士在“第五届拜耳持续教育项目”国际论坛上的讲课内容整理。）

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